PCR, je verižna reakcija s polimerazo, ki se nanaša na dodajanje dNTP, Mg2+, elongacijskih faktorjev in faktorjev za povečanje pomnoževanja v sistem pod katalizo DNA polimeraze, z uporabo matične DNA kot predloge in specifičnih primerjev kot izhodiščne točke podaljšanja, S koraki denaturacije, žarjenja, podaljšanja itd. lahko postopek in vitro replikacije hčerinske verige DNK, ki je komplementarna matični DNK matične verige, hitro in specifično pomnoži katero koli ciljno DNK in vitro.
1. PCR z vročim zagonom
Začetni čas pomnoževanja pri običajnem PCR je, da stroja PCR ne vstavite v stroj PCR, nato pa program začne pomnoževati.Ko je konfiguracija sistema končana, se začne pomnoževanje, ki lahko povzroči nespecifično pomnoževanje, PCR z vročim zagonom pa lahko reši to težavo.
Kaj je PCR z vročim zagonom?Ko je reakcijski sistem pripravljen, se encimski modifikator sprosti pri visoki temperaturi (običajno višji od 90 °C) med začetno fazo segrevanja reakcije ali fazo "vročega zagona", tako da se aktivira DNA polimeraza.Natančen čas aktivacije in temperatura sta odvisna od narave DNA polimeraze in modifikatorja vročega zagona.Ta metoda v glavnem uporablja modifikatorje, kot so protitelesa, afinitetni ligandi ali kemični modifikatorji za zaviranje aktivnosti DNA polimeraze.Ker je aktivnost DNA polimeraze zavrta pri sobni temperaturi, tehnologija vročega zagona zagotavlja veliko priročnost za pripravo več reakcijskih sistemov PCR pri sobni temperaturi, ne da bi pri tem žrtvovali specifičnost reakcij PCR.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transcription PCR) je eksperimentalna tehnika za reverzno transkripcijo iz mRNA v cDNA in njeno uporabo kot predlogo za pomnoževanje.Eksperimentalni postopek je najprej ekstrahirati celotno RNA v tkivih ali celicah, uporabiti Oligo (dT) kot primer, uporabiti reverzno transkriptazo za sintezo cDNA in nato uporabiti cDNA kot predlogo za pomnoževanje PCR za pridobitev ciljnega gena ali zaznavanje genske ekspresije.
3. Fluorescentna kvantitativna PCR
Fluorescentna kvantitativna PCR (kvantitativna PCR v realnem času,RT-qPCR) se nanaša na metodo dodajanja fluorescentnih skupin v reakcijski sistem PCR, z uporabo kopičenja fluorescenčnih signalov za spremljanje celotnega procesa PCR v realnem času in končno z uporabo standardne krivulje za kvantitativno analizo predloge.Pogosto uporabljeni metodi qPCR sta SYBR Green I in TaqMan.
4. Ugnezdeni PCR
Ugnezdeni PCR se nanaša na uporabo dveh nizov začetnikov PCR za dva kroga pomnoževanja PCR, produkt pomnoževanja drugega kroga pa je fragment ciljnega gena.
Če neujemanje prvega para primerjev (zunanji primerji) povzroči pomnoževanje nespecifičnega produkta, je možnost, da drugi par oligonukleotidov prepozna isto nespecifično regijo in nadaljuje pomnoževanje, zelo majhna, tako da pomnoževanje z drugim parom primerjev je bila izboljšana specifičnost PCR.Ena od prednosti izvedbe dveh krogov PCR je ta, da pomaga pomnožiti zadostno količino produkta iz omejene začetne DNK.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR je metoda za izboljšanje specifičnosti reakcije PCR s prilagajanjem parametrov cikla PCR.
Pri dotičnem PCR je temperatura žarjenja za prvih nekaj ciklov nastavljena nekaj stopinj nad najvišjo temperaturo žarjenja (Tm) primerjev.Višja temperatura žarjenja lahko učinkovito zmanjša nespecifično pomnoževanje, hkrati pa bo višja temperatura žarjenja poslabšala ločevanje primerjev in ciljnih sekvenc, kar bo povzročilo zmanjšan izkoristek PCR.Zato je v prvih nekaj ciklih temperatura žarjenja običajno nastavljena tako, da se zniža za 1 °C na cikel, da se poveča vsebnost ciljnega gena v sistemu.Ko se temperatura žarjenja zniža na optimalno temperaturo, se temperatura žarjenja vzdržuje za preostale cikle.
6. Neposredni PCR
Neposredni PCR se nanaša na pomnoževanje ciljne DNA neposredno iz vzorca brez potrebe po izolaciji in čiščenju nukleinske kisline.
Obstajata dve vrsti neposredne PCR:
neposredna metoda: vzemite majhno količino vzorca in ga dodajte neposredno v glavno mešanico PCR za identifikacijo PCR;
metoda razpokanja: po vzorčenju vzorca ga dodajte lizatu, lizirajte, da sprostite genom, vzemite majhno količino liziranega supernatanta in ga dodajte glavni mešanici PCR, izvedite identifikacijo PCR.Ta pristop poenostavlja eksperimentalni potek dela, skrajša čas uporabe in se izogne izgubi DNK med koraki čiščenja.
7. SOE PCR
Spajanje genov s prekrivajočim se podaljškom PCR (SOE PCR) uporablja začetnike s komplementarnimi konci, da produkti PCR tvorijo prekrivajoče se verige, tako da se v nadaljnji reakciji pomnoževanja prek podaljševanja prekrivajočih verig različni viri tehnike A, pri kateri se pomnoženi fragmenti prekrivajo in spojeni skupaj.Ta tehnologija ima trenutno dve glavni smeri uporabe: konstrukcija fuzijskih genov;genska na mesto usmerjena mutacija.
8. IPCR
Inverzni PCR (IPCR) uporablja reverzne komplementarne začetnike za pomnoževanje fragmentov DNA, ki niso oba primerja, in pomnoži neznana zaporedja na obeh straneh znanega fragmenta DNA.
IPCR je bil prvotno zasnovan za določanje zaporedja sosednjih neznanih regij in se večinoma uporablja za preučevanje sekvenc genskih promotorjev;onkogene kromosomske preureditve, kot so genska fuzija, translokacija in transpozicija;in integracija virusnih genov, se prav tako pogosto uporabljajo. Za na mesto usmerjeno mutagenezo kopirajte plazmid z želeno mutacijo.
9. dPCR
Digitalni PCR (dPCR) je tehnika za absolutno kvantifikacijo molekul nukleinskih kislin.
Trenutno obstajajo tri metode za kvantifikacijo molekul nukleinskih kislin.Fotometrija temelji na absorbanci molekul nukleinskih kislin;fluorescenčni kvantitativni PCR v realnem času (PCR v realnem času) temelji na vrednosti Ct, vrednost Ct pa se nanaša na število ciklov, ki ustreza vrednosti fluorescence, ki jo je mogoče zaznati;digitalni PCR je najnovejša kvantitativna tehnologija, ki temelji na metodi PCR z eno molekulo za štetje nukleinskih kislin. Kvantifikacija je absolutna kvantitativna metoda.
Čas objave: 13. junij 2023