Uporaba in previdnostni ukrepi ultrafiltracijske centrifugalne cevi
1) Izberite primerno ultrafiltracijsko cev.Upoštevajte, da se UF membrane razlikujejo po stopnji tolerance na različne kemikalije.Običajno lahko ultrafiltracijske epruvete z mejno vrednostjo molekulske mase 10 kDa izberemo z mejno vrednostjo molekulske mase, ki ne sme biti večja od 1/3 molekulske mase želenega proteina, na primer 35 kDa.Če je molekulska masa želenega proteina okoli 10 kD, se lahko uporabi ultrafiltracijska cev z mejno vrednostjo molekulske mase 3 KD.
(2) Ultrafiltracija, sveže kupljena, je suha, z dodano ultra čisto vodo pred uporabo in vodo, ki je v celoti prešla skozi membrano, ledeno kopel ali hladilnik, predhodno ohlajena za nekaj minut.Vodo nato odlijemo, tj. beljakovinsko tekočino, in koliko dodamo, kar ne presega bele črte na vrhu cevi.Postopek je lahek in ultrafiltracijsko cev je treba pred dodajanjem beljakovinske raztopine predhodno ohladiti na ledu.
3) Tako masa kot težišče naj bi dosegla ravnotežje.Upoštevajte, da vrtilna hitrost in pospešek nista zelo hitra, sicer neposredno poškodujeta ultrafiltracijsko membrano.Začela se je centrifugalna ultrafiltracija (centrifuga predhodno ohlajena na 4 stopinje).Potem ko so vrtljaje na minuto različnih centrifug pretvorili v g, je bilo drugače.Pospešek centrifuge je bil nastavljen na minimum, kar je zmanjšalo pritisk na membrano.Opomba: ne pozabite zapustiti centrifuge, ko centrifuga doseže ciljno hitrost, ali če imate težavo, je ne morete rešiti prvič.Usmerjenost membrane na vreteno je bila prilagojena v skladu z navodili (kotno ohišje centrifuge je membrana pravokotna na os).V praksi je splošna hitrost vrtenja nižja od tiste v navodilih, tako da se lahko podaljša življenjska doba centrifugalne cevi.
3) Tako masa kot težišče naj bi dosegla ravnotežje.Upoštevajte, da vrtilna hitrost in pospešek nista zelo hitra, sicer neposredno poškodujeta ultrafiltracijsko membrano.Začela se je centrifugalna ultrafiltracija (centrifuga predhodno ohlajena na 4 stopinje).Potem ko so vrtljaje na minuto različnih centrifug pretvorili v g, je bilo drugače.Pospešek centrifuge je bil nastavljen na minimum, kar je zmanjšalo pritisk na membrano.Opomba: ne pozabite zapustiti centrifuge, ko centrifuga doseže ciljno hitrost, ali če imate težavo, je ne morete rešiti prvič.Usmerjenost membrane na vreteno je bila prilagojena v skladu z navodili (kotno ohišje centrifuge je membrana pravokotna na os).V praksi je splošna hitrost vrtenja nižja od tiste v navodilih, tako da se lahko podaljša življenjska doba centrifugalne cevi.
(4) Ko koncentrirate na preostali 1 ml, vzemite 50 ul pufrske raztopine, dodajte 10 ul pretoka in preverite, ali je kaj modre barve, da presodite, ali v ultrafiltracijski cevi manjka beljakovina.Če cev pušča, ponovno nalijte zgornjo plast in pretočite v novo cev, da začnete ultrafiltracijo.Če želite natančno ugotoviti, ali so bile epruvete izpuščene, centrifugirajte 10 minut s 5 mg ml BSA pred pretokom, na proteinskem lepilu ali Bradfordovem surovem testu in nadaljujte z dodajanjem preostale koncentrirane raztopine beljakovin (ki deluje na ledu in preprečuje segrevanje beljakovin), dokler je bil dodan ves koncentrat.Med centrifugiranjem bodite previdni, če pride do obarjanja beljakovin, kar vodi do zaprtja epruvete.Če pride do obarjanja, ugotovite, ali je specifični vzrok za obarjanje čezmerna koncentracija beljakovin ali neustrezen pufer;Prvo lahko rešimo z ultrafiltracijo več ultrafiltracijskih epruvet hkrati, z zmanjševanjem koncentracije, drugo pa z izmenjavo različnih puferskih raztopin, dokler ne pride do precipitacije proteina.
(4) Ko koncentrirate na preostali 1 ml, vzemite 50 ul pufrske raztopine, dodajte 10 ul pretoka in preverite, ali je kaj modre barve, da presodite, ali v ultrafiltracijski cevi manjka beljakovina.Če cev pušča, ponovno nalijte zgornjo plast in pretočite v novo cev, da začnete ultrafiltracijo.Če želite natančno ugotoviti, ali so bile epruvete izpuščene, centrifugirajte 10 minut s 5 mg ml BSA pred pretokom, na proteinskem lepilu ali Bradfordovem surovem testu in nadaljujte z dodajanjem preostale koncentrirane raztopine beljakovin (ki deluje na ledu in preprečuje segrevanje beljakovin), dokler je bil dodan ves koncentrat.Med centrifugiranjem bodite previdni, če pride do obarjanja beljakovin, kar vodi do zaprtja epruvete.Če pride do obarjanja, ugotovite, ali je specifični vzrok za obarjanje čezmerna koncentracija beljakovin ali neustrezen pufer;Prvo lahko rešimo z ultrafiltracijo več ultrafiltracijskih epruvet hkrati, z zmanjševanjem koncentracije, drugo pa z izmenjavo različnih puferskih raztopin, dokler ne pride do precipitacije proteina.
(5) Prvih nekaj korakov se uporabi za koncentriranje beljakovin in če je treba pufer spremeniti, nežno dodajte nov pufer (ultrafiltracija skozi ultrafiltracijsko membrano 0,22 um) v približno 1 ml celotne beljakovine in ponovno koncentrirajte na približno 1 ml trikrat. zaporednih krat, s končnim koncentriranim končnim volumnom, ki je odvisen od želene koncentracije beljakovin, na splošno ne več kot 500 ul, ampak tudi do 200 ul.Dosezite 1000 × ali več ob treh priložnostih, v bistvu toliko spremembe medpomnilnika, kot je izračunano z vsaj 10 × ali približno obogatitvijo volumna vsakič.
(5) Prvih nekaj korakov se uporabi za koncentriranje beljakovin in če je treba pufer spremeniti, nežno dodajte nov pufer (ultrafiltracija skozi ultrafiltracijsko membrano 0,22 um) v približno 1 ml celotne beljakovine in ponovno koncentrirajte na približno 1 ml trikrat. zaporednih krat, s končnim koncentriranim končnim volumnom, ki je odvisen od želene koncentracije beljakovin, na splošno ne več kot 500 ul, ampak tudi do 200 ul.Dosezite 1000 × ali več ob treh priložnostih, v bistvu toliko spremembe medpomnilnika, kot je izračunano z vsaj 10 × ali približno obogatitvijo volumna vsakič.
Čas objave: 9. nov. 2022